الف) مقدمه

یکی از مکانیسم‌های آسیب سلولی در جانوران و گیاهان پراکسیداسیون لیپیدی می‌باشد. پراکسیدهای لیپیدی شاخص‌های بسیار ناپایداری از استرس اکسیداتیو در سلول‌ها می‌باشد که با تجزیه به ترکیبات واکنش­پذیری مثل مالون دی‌آلدهید (MDA) و 4-هیدروکسی نئوننال (4-HNE) تبدیل می‌شوند. اکسیداسیون لیپیدها در in vitro بواسطه انواع فاکتورهای پرواکسیدانت و در in vivo  در اثر بسیاری از بیماری‌ها یا پیری رخ می‌دهد. سنجش محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدی یکی از روشهای مقبول برای اثبات آسیب اکسیداتیو می‌باشد. فراورده‌های آلدهیدی فوق به عنوان مارکرهای استرس اکسیداتیو پذیرفته شده‌اند.

مواد واکنش­پذیر با تیوباربیتوریک اسید((TBARS یک سنجش رایج برای نشان دادن پراکسیداسیون لیپیدی می‌باشد. پروتکل حاضر یک روش ساده و سریع در بررسی نمونه‌های دارویی، غذایی، انسانی، جانوری و گیاهی می‌باشد. از نظر مکانیسمی MDA با نسبت 1:2 با تیوباربیتوریک اسید ترکیب می‌شود (شکل 1).

ترکیبMDA-TBA  از واکنش MDA موجود در نمونه‌ها با TBA تشکیل می‌شود و می‌توان مقدار آن را با اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری کرد. سطح و مقدار TBARS را می‌توان از طریق استاندارد MDA تعیین کرد.

آزمون TBARS اطلاعات وسیعی از فعالیت رادیکال‌های‌ آزاد شده شرایط مختلف از قبیل بیماری‌ها و اثرات پراکسیدانت‌ها و آنتی اکسیدانت بدست می‌دهد. اگرچه اختصاصیت TBARS برای ترکیبات دیگری غیر از MDA بحث برانگیز است اما این روش برای نمایش پراکسیداسیون لیپیدی یک روش پذیرفته شده است. لیپیدهای دارای اسیدهای چرب غیر اشباع مقادیر TBARS بیشتری تولید می‌کنند. TBARS مداخله‌گر محلول موجود در نمونه را می‌توان با رسوب دادن لیپوپروتئین‌ها توسط اسید مثل اسید استیک به حداقل رساند.

نمونه‌های بیولوژیکی ممکن است دارای مخلوط از مواد واکنش‌پذیر با تیوباربیتوریک ‌اسید(TBARS) مثل هیدروپراکسیدها و آلدهید داشته باشند. هرگاه مقادیر TBARS بالایی به دست آمد باید سنجش‌های اختصاصی‌تری از قبیل HPLC بکار گرفته شود.

کیت شرکت آرسام فرا زیست یک سیستم ساده، تکرار پذیر و ارزان قیمت برای بررسی پراکسیداسیون لیپیدی در نمونه‌های ادرار، پلاسما، سرم، لیزات سلولی، هموژنات بافتی و حتی نمونه­های غذایی مثل کباب، چیپس و سایر سرخ­کردنی­ها می‌باشد. همچنین کیت حاضر دارای استاندارد MDA به عنوان کنترل مثبت می‌باشد. هر کیت دارای معرف‌های کافی برای 100 سنجش توسط اسپکتروفتومتر و بیش از 200 سنجش توسط میکروپلیت ریدر  می‌باشد.

ب) اساس آزمون

آزمون TBARS یک روش کمّی مستقیم در اندازه‌گیری MDA نمونه‌‌های زیستی می‌باشد. نمونه‌های دارای MDA و استانداردهای MDA ابتدا با TBA در   °C95 واکنش می‌دهند. بعد از چند دقیقه انکوباسیون، نمونه‌ها و استانداردها را می‌توان توسط اسپکتروفتومتر یا فلوریمتر سنجش کرد. مقدار MDA  نمونه‌های مجهول را می‌توان با مقایسه آن با منحنی استاندارد MDA  تعیین کرد.

ج) محتویات کیت

موادی که در کیت گنجانده نشده است

• نمونه‌های مجهول دارای MDA، پلاسما، سرم، ادرار، لیزات سلولی یا بافتی
• میکروتیوب و سانتریفیوژ
• هیتربلاک، انکوباتور یا حمام آب گرم
• n- بوتانول
• پلیت ته صاف 96 چاهکی
• میکروپلیت ریدر یا اسپکتروفتومتر

د) نگهداری کیت

تمامی محتویات کیت بجز استاندارد MDA در ° C4 نگهداری شود. استاندارد MDA در 20- نگهداری شود.

ه) آماده سازی معرف‌ها

 معرف TBA: معرف TBA را درست قبل از مصرف تهیه کنید. TBA  را در غلظت  mg/ml2/5 در آب دوبار تقطیر تهیه نمایید.

• محلول: 1X BHT آنتی­اکسیدانت BHT را در غلظت نهایی X1 به هر نمونه بیافزایید تا از اکسیداسیون بیشتر نمونه ها در طی آماده سازی و واکنش TBA جلوگیری شود. برای تهیه µl 300 محلول 1X کافی است µl 3 از محلول X 100 برداشته شود.

و) آماده سازی نمونه

تمامی نمونه‌ها باید بلافاصله بعد از تهیه سنجش شوند یا اینکه در C°80- بمدت 2-1 ماه ذخیره شود.

1- نمونه بافتی: به دلیل اینکه هموگلوبین با آزمون MDA تداخل ایجاد می‌کند بافت باید عاری از خون باشد. نمونه بافت را در بافر لیز دارای 1X BHT حل کنید (20% وزنی حجمی: برای مثال 2/0 گرم را در حجم نهایی ml1 در بافر لیز هموژن کنید). بافت را بر روی یخ هموژن نموده و بمدت 5 دقیقه در g14000 سانتریفیوژ کرده و سوپرناتانت را جمع آوری کنید. سوپرناتانت را می‌توان مستقیماً برای تعیین مقدار TBARS یا MDA اندازه­گیری کرد و مقداری از آن (µl 10)را برای تعیین غلظت پروتئین توسط روش برادفورد یا لوری در ^◦C 20- نگه داشت.

2- نمونه پلاسما: به منظور کاهش هموگلوبین و تداخل ناشی از آن نمونه پلاسما بلافاصله بعد از اخذ خون جدا شود. سپس 1X BHT به آن افزوده شود تا دچار اکسیداسیون اضافی نشود. نمونه پلاسما را می‌توان مستقیماً بدون اینکه تحت فرایند خاصی قرار گیرد سنجش کرد.

3- نمونه سلول: سلولها را به مقدار 10⁷ × 2-1 سلول در هر میلی لیتر در بافر لیز دارای 1X BHT حل کرده و بر روی یخ سونیکه یا هموژن کنید و بعد از سانتریفیوژ در g 14000 به مدت 5 دقیقه مایع رویی را برای سنجش جمع­آوری نمایید.

4- نمونه ادرار: به منظور حذف ذرات نامحلول ادرار را در g 14000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کرده و سوپرناتانت را مستقیماً برای سنجش MDA استفاده کنید.

ز) آماده سازی منحنی استاندارد برای سنجش توسط اسپکتروفتومتر

1) با رقیق سازی سریالی استاندارد mM 1 MDA در محدوده غلظتی Mµ200- 0 در آب دوبار تقطیر یا دیونیزه استانداردهای MDA را مطابق جدول زیر در میکروتیوب­ها تهیه کنید. لوله شماره 10 بلانک می­باشد.

نکته: توصیه می‌شود استانداردها را با 2 تکرار تهیه کنید.

2) lµ250 از معرف TBA به هر یک از میکروتیوب­ها اضافه نمایید.

3) میکروتیوب‌ها را در دمای C°95 به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.

4) میکروتیوب‌ها را پس از سرد کردن در دمای اتاق یا روی یخ، در طول موج nm 532 توسط اسپکتروفتومتر قرائت نمایید.

ح) روش سنجش نمونه­ها

• µl 250 از نمونه­ها (مایع رویی هموژنات) را با µl 500 از TCA مخلوط کرده و بعد از انکوباسیون در دمای C°95 به مدت 5 دقیقه (تسریع در رسوبدهی)، در g 14000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ نمایید. ( پروتئین­ها توسط TCA رسوب داده می­شوند و از محیط واکنش حذف می­شوند)
• µl 500 مایع رویی فوق را با µl 250 از محلول TBA مخلوط کرده و میکروتیوب‌ها را در دمای C°95 به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.
• میکروتیوب‌ها را پس از سرد کردن در دمای اتاق یا روی یخ، در طول موج nm 532 توسط اسپکتروفتومتر قرائت نمایید.
• (اختیاری) جداسازی توسط بوتانول: برای ممانعت از تداخل هموگلوبین با مشتقات آن جداسازی توسط بوتانول توصیه می‌شود.

الف) lµ 600 از مایع رویی مرحله 4 به میکروتیوب دیگر ریخته شود و lµ 600 n -بوتانول روی آن افزوده شود و بعد از 2-1 دقیقه ورتکس در دور g10000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شود.

ب) فراکشن بوتانول را برای آنالیزهای بعدی جمع‌آوری کنید.

نکته 1: کنترل منفی یا بلانک به منظور صفر نمودن دستگاه فراموش نشود. برای این منظور یک میکروتیوب اضافی به موازات مراحل کار اضافه شود اما بجای نمونه آب مقطر اضافه شود و بقیه مراحل همانند ادامه فرایند آماده سازی نمونه یا استاندارد است.

نکته 2: برای خوانش توسط اسپکتروفتومتر از کووت پلاستیکی یا شیشه­ای استفاده شود.

نکته 3: برای خوانش توسط دستگاه میکروپلیت­ریدر کافی است 200 میکرولیتر از حجم­های نهایی فوق را به میکروپلیت منتقل کنید و یا اینکه مقادیر مراحل مختلف را به نسبت کم کنید (Scale down).

نکته 4:برای اندازه گیری فلوریمتر از طول موج تهییجی nm540 و طول موج نشری nm590 استفاده شود.

ط) تفسیر نتایج

1) بعد از اخذ داده‌ها توسط اسپکتروفتومتر و یا میکروپلیت ریدر منحنی استاندارد را در برنامه Excel به صورت زیر ترسیم کنید. سپس با به دست آوردن خط برازش (trendline) و معادله آن خط، مقدار x جذب نمونه‌های مورد مطالعه را از معادله خط ساده y = ax + b  بدست آورید.

2) برای بدست آوردن مقدار MDA بر حسب M/mg proteinµ مقدار هر نمونه را به مقدار پروتئینی آن تقسیم نمایید. مقدار پروتئین توسط روش برادفورد یا لوری قابل برآورد می­باشد.

ی) رفع اشکال

ک) منابع:

1) Zeb A, Ullah F. A Simple Spectrophotometric Method for the Determination of Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Fried Fast Foods. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2016;2016:5

2) Khoubnasabjafari M, Ansarin K, Jouyban A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. Bioimpacts. 2015;5(3):123-7.

3) Mertens K, Rogiers V, Vercruysse A. Measurement of malondialdehyde in cultures of adult rat hepatocytes. Toxicology in Vitro. 1993 1993/07/01/;7(4):439-41.

پیوست‌ها

دریافت

[کیت سنجش مالون دی آلدهید (پراکسیداسیون لیپیدی)]

633 kB