الف) مقدمه
Taq DNA لیگاز آنزیمی با وزن مولکولی KDa 74 است که تشکلیل پیوند فسفودیاستر بین فسفات ´5 و هیدروکسیل ´3 دو الیگونوکلئوتید مجاور هم را به کمک NAD+ کاتالیز میکند. واکنش لیگاسیون تنها زمانی رخ میدهد که دو نوکلئوتید مجاور هم کاملا با بازهای روبرو مکمل باشد و همچنین بین آنها فاصلهای وجود نداشته باشد. آنزیم Taq DNA لیگاز در دماهای بالا یعنی °C45-65 فعال است.
ب) منبع آنزیم
آنزیم حاضر یک آنزیم نوترکیب است که ژن آن مربوط به لیگاز Thermus aquaticus HB8 میباشد که در باکتری E.coli کلون، بیان و تخلیص شده است.
ج) کاربرد
1- تشخیص ژنی اختصاصی الل (Allele-specific gene detection) با استفاده از واکنش تشخیص لیگاز و واکنش زنجیرهای لیگاز
2- جهشزایی که توسط درج یک نوکلئوتید فسفریله شده در طول تکثیر PCR انجام میشود.
3- Gibson assembly
4- تعیین توالی نسل جدید(NGS)
5- Ligase detection reaction (LDR)
6- Repeat expansion detection (RED)
7- Ligase chain reaction (LCR) یا Ligation amplification reaction (LAR)
8- Oligonucleotide ligation assay (OLA)
9-synthesis High fidelity gene
10- Simultaneous multiple site mutagenesis
د) شرایط واکنش
DNA و آنزیم، در بافر Taq DNA لیگاز 1x به مدت 15 دقیقه در دمای °C45 یا در دستگاه ترموسایکلر که دارای برنامه دمایی خاصی برای واکنشهای تشخیصی است، انکوبه شود. واکنش لیگاسیون را با انکوباسیون مخلوط واکنش در دمای °C70 به مدت 10 دقیقه، میتوان متوقف کرد.
نکته
- بافر واکنش به دلیل اینکه دارای NAD+ است در دمای °C70- نگهداری شود.
- Taq DNA لیگاز به دلیل اینکه در دمای پایین فعال نیست جایگزین T4 DNA لیگاز نمیتواند باشد. 2 یا 4 باز انتهای چسبنده که در هضمهای آنزیمهای محدود کننده ایجاد شده است در دماهای پایین در مجاور هم پایدار میشوند.
- آنزیم Taq DNA لیگاز در بافرهای انواع DNA پلیمرازها فعال است.