الف) مقدمه

آنزیم‌های DNA پلیمراز با صحت بالا ( High fidelity DNA polymerases) برای تکثیر توالی‌‍‌هایی که نیاز به تصحیح جهش در حین انبوه‍‍‌‍ سازی دارند،‍ حیاتی هستند. آنزیم DNA  پلیمراز فیو‌ژن یک آنزیم دارای عملکرد قوی و صحت بالایی می‌باشد که در تمامی کاربردهای PCR  می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. این آنزیم دارای یک ساختار خاص می‌باشد، یعنی به دلیل داشتن دٌمین اضافی سرعت و صحت را افزایش می‌دهد. این آنزیم برای تکثیر قطعات DNA در کلون­سازی ژن و قطعات طویل ایده‌آل می‌باشد. فیوژن با میزان خطای 50 برابرکمتر از  DNA پلیمراز Taq و 6 برابر کمتر از آنزیم DNA پلیمراز Pfu، یکی از آنزیم‌های دقیق در تکثیر ژن توسط PCR است.  این آنزیم دارای فعالیت پلیمرازی ´3 → ´5 و فعالیت اگزونوکلئازی ´5→´3 می‌باشد و تولید محصولاتی با انتهای صاف (blunt) می‌کند. به همراه آنزیم فیوژن یک بافر استاندارد 5X Phusion HF ، به علاوه یک بافر  5X Phusion GC ارسال می­شود که برای الگوهای پیچیده یا غنی از GC می‌توان مورد استفاده قرار داد. هر کدام از بافرها دارای MgCl₂ نیز می‌باشند. به علاوه، واکنش‌های PCR را می‌توان با استفاده از DMSO  و MgCl₂ که همراه آنزیم ارسال می‌شود، نیز بهینه سازی کرد.

ب) کاربردهای فیوژن

• کلونینگ
• PCR با صحت بالا
• تکثیر قطعات طولانی و سخت
• جهش زایی هدفدار
• تکثیر دقیق توالی‌های ژنی باکتری‌ها به منظور تعیین توالی

ج) محتویات کیت

نگهداری: کیت فیوژن بر روی یخ منتقل می­شود و بلافاصله پس از رسیدن در دمای °C 20- نگهداری شود.

د) معرف­هایی که توسط محقق باید تامین شود:

1- مخلوط dNTPs

2- پرایمرهای پیشرو (Forward) و معکوس (Reverse)

3- DNA الگو

4- آب عاری از نوکلئاز

ه) روش انجام PCR

 دستورالعمل حاضر برای واکنش­های معمولی PCR  می‌باشد. تکثیر الگوهایی با GC بالا، ساختار‌های ثانویه بالا و غلظت های پایین الگو یا قطعات طویل نیاز به بهینه سازی بیشتری دارد.

• راه ­اندازی واکنش‌ (Reaction Setup)

توصیه می‌شود اجزای واکنش PCR را در روی یخ مخلوط شود و سریع به ترموسایکلر منتقل شود. توجه شود که ترموسایکلر قبل از انتقال اجزای واکنش در دمای دناتوراسیون  ºC98 تنظیم شده باشد سپس تمامی اجزا مخلوط شده و قبل از استفاده سانترفیوژ شود. قابل ذکر است ممکن است پروتکل فیوژن با پروتکل پلیمرازهای استاندارد کمی متفاوت باشد.

شرایط پیشنهادی زیر برای PCR های معمولی است و برای سایر PCR  ها باید بهینه سازی شود.

• برنامه PCR

• توصیه­‌های عمومی

استفاده از الگوهای DNA با خلوص بالا و کیفیت بالا موفقیت واکنش PCR  را افزایش می‌دهد. مقادیر DNA  الگو برای یک واکنش با حجم  µl50 به صورت زیر است.

توجه شود اگر الگو cDNA است حجم الگوی مورد استفاده کمتر از 10% از حجم کل واکنش باشد.

• پرایمرها

طول پرایمرهای مورد استفاده بهتر است 40-20 نوکلئوتید باشد و مقادیر GC آنها بین 60-40% می­باشد. غلظت نهایی هر پرایمر در واکنش  PCR برای، DNA  پلیمراز فیوژن بین  µM 1- 2/0 می تواند متغیر باشد. توصیه می شود غلظت µM  5/0 استفاده شود.

• منیزیم و سایر افزودنی ها 

Mg²⁺ برای فعالیت DNA  پلیمراز فیوژن ضروری است غلظت Mg²⁺  در بافر HF 1X و GC 5/1  میلی مولار است. غلظت بالای Mg²⁺  از دناتوراسیون DNA ممانعت می کند و باعث اتصال غیرویژه پرایمر می شود.

غلظت بهینه Mg²⁺ تحت تاثیر غلظت dNTP، DNA الگو و مکمل های موجوددر واکنش، قرار می گیرد. اگر در محیط شلاتوری مثل EDTA وجود داشته باشد، غلظت Mg²⁺ را باید افزایش داد. می‌توان غلظت ²⁺Mg را با افزایش فاصله غلظتی mM 5/0 بهینه سازی کرد.

تکثیر DNA های پیچیده مثل DNA های دارای GC بالا یا ساختار ثانویه پیچیده را می توان با افزودن DMSO در غلظت نهایی 3% بهینه سازی کرد. توجه شود که می‌توان غلظت DMSO  را با افزایش فاصله غلظتی 2% تا حداکثر10% بهینه سازی کرد. توصیه می شود که در غلظت بالای DMSO باید دمای اتصال پرایمر را پایین تر تنظیم کرد زیرا DMSO دمای T_m پرایمر را افزایش می دهد. فیوژن با افزودنی های دیگر از قبیل فرمامید و گلیسرول سازگار است.

• داکسی نوکلئوتیدها

غلظت dNTPs معمولا µM 200 برای هر نوکلئوتید است. آنزیم فیوژن قادر به استفاده از dUTP نمی باشد و بنابراین برای پرایمرها یا الگوهای دارای یوراسیل توصیه نمی شود.

• غلظت آنزیم فیوژن

توصیه می شود برای یک واکنشµl 50 یک واحد آنزیم استفاده شود. اما ممکن است بر حسب شرایط واکنش به ویژه برای قطعات با طول بیشتر ازkb  5، 2- 5/0واحد نیز معتبر باشد.

• بافر

بافرهایی که به همراه آنزیم ارسال می شوند شامل بافر5x  HF و بافر GC می باشند. برای واکنش های معمولی PCR بافر 5x  HF توصیه می­شود. اما برای الگوهای پیچیده مثل DNA های دارای GC بالا، برای تکثیر بهتر بافر GC ضروری است. در آزمایشاتی که بافر HF جواب نداد باید از بافر GC استفاده کرد. برای واکنش هایی که نیاز به شرایط بدون دترجنت دارند بافر بدون دترجنت نیز موجود است. (واکنش هایی مثل میکرو اری،DHPLC)

• دناتوراسیون

دناتوراسیون اولیه در ºC98 به مدت 30 ثانیه برای بسیاری از DNA های خالص کافی است. اما برای الگوهای پیچیده می توان زمان دناتوراسیون را تا 3 دقیقه نیز افزایش داد. در مرحله چرخه­ای PCR تا حد امکان باید زمان دناتوراسیون را کاهش داد. بطور معمولی 10-5 ثانیه دناتوراسیون در  ºC98 توصیه می شود.

• اتصال (Annealing)

دمای اتصال پرایمر در صورت استفاده از فیوژن باید بالاتر از دمای اتصال سایر پلیمرازها باشد. بطور کلی پرایمرهای بلندتر از 20 نوکلئوتید 3 درجه سانتی­گراد بالاتر از T_m پرایمر دارای پایین­ترین T_m مدت 30-10 ثانیه متصل می شوند. هرگاه طول پرایمر کمتر از 20 نوکلئوتید است T_m پایین تر پرایمر در نظر گرفته می شود. با وجود این می‌توان از شیب دمایی برای بهینه سازی اتصال پرایمر کرد.

• مرحله سنتز (Extension)

بطور کلی برای سنتز DNA دمای ºC 72 توصیه می شود. زمان سنتز بر حسب طول و پیچیدگی قطعه مورد نظر متفاوت است. عموما برای هر کیلوباز 15 ثانیه کافی است برای تکثیر قطعات پیچیده مثل DNA ژنومی برای هر کیلوباز 30 ثانیه زمان توصیه می شود. زمان تکثیر برای cDNA می تواند تا 40 ثانیه به ازای هر کیلوباز افزایش یابد.

• تعداد چرخه ­ها

عموما 35-30 چرخه، برای تولید محصول کافی می­باشد. هرگاه دمای اتصال پرایمر 72 یا بیشتر از ºC 72 بود PCR  دو مرحله ای توصیه می شود.

• محصول PCR

محصول PCR تکثیریافته توسط فیوژن انتهای کور (blunt) ایجاد می کند. اگر محصول حاصله در کلونینگ استفاده می شود کلونینگ انتهای کور توصیه می شود. هرگاهTA  کلونینگ انجام شود، توصیه می شود قبل از افزودن A، محصول تکثیریافته تخلیص شود و سپس اضافه شود چون فیوژن هرگونه باز اضافی را تجزیه می کند.

نکته: افزودن باز dA توسط DNA پلیمراز Taq انجام می شود.

پیوست‌ها

Download

[آنزیم فیوژن نوترکیب (Recombinant Phusion) ]

0 kB