الف) مقدمه
روش لوری یکی از متداولترین و قدیمی ترین روشهای اندازه گیری غلظت پروتئین تام در یک محلول است که در سال 1951 توسط الیور لوری ارایه گردیده است. روش لوری مشابه روش بیوره بوده، با این تفاوت که مراحل، معرف ها و و حساسیت تشخیصی روش لوری بیشتر است. در این روش ابتدا در محیط قلیایی، پروتئین با سولفات مس و تارتارات واکنش داده و کمپلکسی را با چهار پیوند پپتیدی تشکیل می دهد. در مرحله بعد، کمپلکس تشکیل شده به همراه زنجیره جانبی اسیدهای آمینه تیروزین، تریپتوفان و تاحدودی سیستئین با معرف فولین (فسفومولبیدیک/فسفوتنگستیک اسید) واکنش داده و باعث احیای آن و تولید رنگ آبی تیره در محدوده 650 و 750 نانومتر می گردد. حد تشخیص روش لوری بین 100-5 میکروگرم می باشد.
مانند سایر روش های سنجش غلطت پروتئینی، تغییر رنگ حاصله تحت تاثیر ترکیبات موجود در بافر نمونه است. یونهای پتاسیم، منیزیم، آمونیوم،EDTA، Tris-HCl، عوامل احیا کننده، غلظت بالای دترجنت ها و کربوهیدراتها از عوامل مداخله گر با روش لوری محسوب می شوند.
غلظت پروتئین عموما به کمک استانداردهای متداول پروتئینی تعیین و گزارش می شود در این کیت از آلبومین سرمی گاو (BSA) به عنوان پروتئین استاندارد استفاده شده است. منحنی سری رقت های BSA با غلظت های معلوم ترسیم می گردد سپس غلظت پروتئین مجهول بر اساس منحنی استاندارد مشخص می گردد.
ب) محتویات کیت
ج) نگهداری
محتویات کیت بجز BSA (20-) در یخچال نگهداری گردد.
د) ترسیم منحنی استاندارد
1) پروتکل لوله آزمایش
ابتدا غلظت mg/ml 1/0 محلول استاندارد BSA تهیه کنید. بدین منظور کافی است از غلظت استوک فوق (mg/ml 1) یک به ده رقت سازی نمایید. سپس بر اساس جدول زیر در میکروتیوب یا لوله آزمایش شیشه ای مقادیر زیر را تهیه کنید.
- به هر یک از نمونه های فوق µl 180 محلول A افزوده و در ◦C 55 به مدت 10 دقیقه انکوبه نمایید.
- بعد از سرد کردن لوله ها µl 20 از محلول B به هر یک از نمونه ها اضافه نموده و 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه نمایید.
- سپسµl 600 معرف فولین کاری به نمونهها اضافه کرده و پس از 10 دقیقه جذب آنها را در طول موج 650 نانومتر قرائت نمایید.
نکته: توصیه می شود برای هر یک از غلظتهای فوق حداقل دو تکرار انجام شود.
2- پروتکل میکروپلیت
برای ترسیم منحنی استاندارد به روش میکروپلیت به صورت زیر عمل شود
- به هر یک از نمونه های فوق µl45 محلول A افزوده و در ◦C 55 به مدت 10 دقیقه انکوبه نمایید.
- بعد از سرد کردن لوله ها µl5 از محلول B به هر یک از نمونه ها اضافه نموده و 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه نمایید.
- سپس µl150 معرف فولین کاری به نمونه ها اضافه کرده و پس از 10 دقیقه جذب آنها را در طول موج 650 نانومتر قرائت نمایید.
ه) روش کار سنجش نمونه
خلاصه روش کار در جدول زیر آورده شده است اما مشروح آن در ادامه بیان شده است.
- برای تعیین غلظت پروتئین در نمونهها، مقدار 50 میکرولیتر از هر نمونه سلولی را با آب دوبار تقطیر به حجم µl 200 رسانده، و پس از افزودن180میکرولیتر محلول A به مدت 10 دقیقه در حمام◦C 55 انکوبه نمایید.
- بعد از سرد کردن نمونه‌های مرحله قبل در دمای آزمایشگاه، مقدار 20 میکرولیتر از محلول B را به هر لوله اضافه و به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه کنید.
- مقدار 600 میکرولیتر از محلول C را به هر نمونه اضافه و در دمای 55 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه شود.
- بعد از سرد کردن ، میزان جذب نمونه‌هارا در طول موج 650 نانومتر قرائت گردد.
نکته 1: برای بلانک تمامی موارد ذکر شده در بالا انجام شود و تنها به جای نمونه، 200 میکرولیتر آب دوبار تقطیر استفاده شود.
و)محاسبه غلظت نهایی پروتئین از روی عدد جذب
به منظور بدست آوردن غلظت پروتئین هر نمونه از منحنی استاندارد BSA استفاده شود. با ترسیم مقادیر استاندارد بر علیه عدد جذب آنها منحنی استاندارد به دست میآید. بعد از ترسیم نمودار، برازش خطی (Trendline)، معادله خط و ضریب رگرسیون را نیز بر روی نمودار بهدست بیاورید. با جایگزینی عدد جذب به جای Y مقدار X را محاسبه نموده و آنرا به ضریب رقت (در کیت حاضر عدد 4) ضرب نمایید. واحد غلظت پروتئین µg/ml می باشد.
نکات:
1) توجه شود با هر دستگاهی که نمونه های منحنی استاندارد قرائت میشود با همان دستگاه جذب نمونه مجهول خوانده شود.
2) توجه شود که جذب نمونه های استاندارد بیشتر از عدد 8/. نباشد.
3) در صورتیکه مقدار جذب نمونه پروتئینی مجهول بیشتر از عدد 8/. باشد حجم پروتئین برای سنجش، کمتر انتخاب شود یا رقیق شود.
4) حجم پروتئین برای سنجش در روش لوله آزمایش تا µl 50 و در روش میکروپلیت تا µl 20 میتواند باشد. در صورتیکه با مقادیر فوق جذب بیشتر از 8/. شد، مقادیر کم شود.
 دریافت | [دستورالعمل کیت سنجش پروتئین- روش لوری] | 577 kB |
