کیت سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز

(Catalase Assay Kit)

(Cat-No: SK1193)

الف) مقدمه

آنزیم کاتالاز (EC 1.11.1.6; 2H₂O₂oxidoreductase)یک آنتی اکسیدانت آنزیمی است که در اکثر سلولهای هوازی وجود دارد. این آنزیم مسئول تجزیه پراکسید هیدروژن، گونه فعال اکسیژنی که محصول متابولیسم طبیعی سلول و فرایندهای پاتوژنی می باشد، به اکسیژن ملکولی و دو ملکول آب می­ باشد. علاوه بر این، این آنزیم فعالیت پراکسیدازی نیز دارد که در آن از الکل­هایی با وزن ملکولی پایین می تواند به عنوان دهنده الکترون استفاده کند. از اینرو، الکل های آلیفاتیک به عنوان سوبسترای ویژه آنزیم کاتالاز عمل می­ کنند در حالی که سایر آنزیم های پراکسیدازی نمی توانند از این سوبستراها استفاده کنند.

ب) اساس سنجش کیت

در کیت سنجش فعالیت کاتالاز شرکت آرسام فرا زیست از عملکرد پراکسیدازی کاتالاز برای تعیین فعالیت آنزیم استفاده می­ شود. این روش بر پایه واکنش آنزیم با متانول در غلظت مناسبی از پراکسید هیدروژن می باشد. فرمالدهید تولید شده در این واکنش با روش رنگ سنجی اندازه گیری می­شود. معرف کروموژن (پرپالد) با فرمالدهید، حلقه هتروسیکل را تشکیل می­ دهد که طی اکسیداسیون از حالت بیرنگ به رنگ بنفش تغییر می یابد.

این کیت را می توان برای اندازه گیری فعالیت کاتالاز در نمونه های پلاسما، سرم، لیزات گلبول قرمز، بافت و سلول به کار برد.

میزان حساسیت کیت موجود: U 2

ج) محتویات کیت

د) نگهداری کیت

تمامی محتویات کیت بجز معرف کروموژن در ° C4 نگهداری شود. معرف کروموژن در 20- نگهداری شود.

ه) آماده‌سازی نمونه

برای سنجش فعالیت کاتالاز نمونه­های سلولی و بافتی باید قبل از سنجش هموژنیزاسیون انجام شود. اما نمونه­ های سرمی، پلاسمایی و یا مایعات بدن را می­ توان بعد از تعیین غلظت پروتئین مستقیماً برای سنجش به کار برد.

• تهیه لیزات سلولی

 10⁶ سلول را جمع آوری کرده و با PBS شسته و بعد از حذف آن، پِلِت سلولی را در^°C 80- تا زمان استفاده نگهداری کنید. برای تهیه لیزات سلولیµl100-50  از بافر لیز را به پلت سلولی اضافه نمائید و سلول‌ها را با پیپت کردن کاملا حل کرده و به مدت 30 دقیقه در روی یخ قرار دهید و هر 10 دقیقه یکبار به مدت 15 ثانیه ورتکس نمایید. سرانجام به مدت 5 دقیقه با حداکثر دور rpm)13000( آن را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برای سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز جمع آوری کنید. مقداری از مایع رویی را برای تعیین غلظت پروتئینی آن توسط روش برادفورد یا لوری اختصاص دهید.

• تهیه هموژنات بافتی

بافت باید کاملا با PBS شسته شود تا سلولهای خونی حذف شوند. mg200 از بافت را در یک میلی­لیتر بافر لیز هموژن کرده و به مدت 5 دقیقه در میکروسانتریفیوژ یخچال دار با سرعت حداکثر سانتریفیوژ کنید و مایع رویی را برای سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز جمع آوری کنید. مقداری از مایع رویی را برای تعیین غلظت پروتئینی آن توسط روش برادفورد یا لوری اختصاص دهید.

و) ترسیم نمودار استاندارد

برای رسم نمودار استاندارد مقدار 50 میکرولیتر از غلظت­های معلوم استاندارد­های موجود در کیت (10 تا 160 میکرومولار) برداشته و مطابق روش گفته شده در بخش زیر عمل شود. سپس مقدار جذب nm550 نمونه های استاندارد بر علیه غلظت­های معلوم به صورت زیر ترسیم شود.

ز- سنجش فعالیت آنزیمی نمونه

روش کار

1. 200 میکرولیتر بافر واکنش را با 150 میکرولیتر متانول و 30 میکرولیتر استوک کاری H₂O₂(ردیف 8 جدول محتویات کیت) در یک میکروتیوب ریخته و به آرامی تکان دهید.
2. 50 میکرولیتر نمونه/ محلول استاندارد را به هر میکروتیوب اضافه نموده و پس از مخلوط کردن، به مدت 20 دقیقه دور از نور انکوبه نمایید. برای نمونه شاهد، از 50 میکرولیتر بافر واکنش استفاده نمایید.
3. برای خاتمه واکنش، 150 میکرولیتر محلول هیدروکسید پتاسیم را اضافه نمایید. سپس بلافاصله، 150 میکرولیتر معرف کروموژن را به هر میکروتیوب افزوده و ورتکس نمایید.
4. پس از 10 دقیقه انکوباسیون، 150 میکرولیتر پتاسیم پریدات را به نمونه ها افزوده و به مدت 10 دقیقه در دور g 10000 سانتریفیوژ نمایید.
5. در نهایت جذب نمونه ها را در 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتری خوانش نمایید.

نکته: مقادیر ذکر شده در فوق برای روش لوله آزمایش و خوانش با اسپکتروفتومتر می­ باشد. در صورتی که از الایزا ریدر استفاده می شود مقادیر فوق به نسبت یکسان کم شود (یک چهارم مقادیر فوق استفاده شود).

ح) محاسبه

ابتدا، غلظت فرمالدهید تشکیل شده در نمونه ها را بر حسب میکرومولار با استفاده از معادله خط نمودار استاندارد محاسبه نمایید. با جایگزینی عدد جذب بدست آمده به جای Y در معادله خط نمودار استاندارد،X (غلظت فرمالدهید) به دست می­آید. در نهایت، فعالیت آنزیم به کمک معادله زیر بر حسبU بدست می­آید.

U: هر واحد آنزیمی به مقدار آنزیمی گفته می­ شود که تشکیل یک نانومول فرمالدهید را در یک دقیقه کاتالیز نماید.

از آنجایی که درروش کار کیت حاضر µl 50 نمونه استفاده شده است و حجم واکنش430 میکرولیتر می­باشد ضریب رقت در این کیت 6/8 می­باشد.

نکته: چنانچه لازم باشد فعالیت آنزیم نسبت به پروتئین کل نمونه، نرمال سازی شود کافی است عدد بدست آمده در فوق به غلظت پروتئین کل نمونه تقسیم و  بر حسب یک واحد آنزیمی بر میلی­گرم پروتیئن (U/mg) بیان شود.

تصویری از استانداردهای کیت سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز

 در صورت بروز هر گونه ابهام، مشکل یا اشتباه با کارشناسان پشتیبانی فنی آرسام فرا زیست در میان بگذارید. کارشناسان ما با شماره تلفن71-574-71-0914 از طریق تلگرام و یا ایمیل این آدرس ایمیل توسط spambots حفاظت می شود. برای دیدن شما نیاز به جاوا اسکریپت دارید برای ارائه راهنمایی و رفع مشکل حاضر هستند.

پیوست‌ها

دریافت

[کیت سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز]

619 kB