الف) مقدمه

به طور کلی دو نوع سیستم آنتی اکسیدانتی وجود دارد که شامل: 1) سیستم آنزیمی در برگیرنده آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز (SOD )، کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GP_x)2) سیستم غیر آنزیمی شامل اسید اوریک، ویتامین‌های  Cو E، گلوتاتیون، بیلی­روبین، و آلفا لیپوئیک اسید می‌باشد. ظرفیت آنتی اکسیدانتی تام به مجموعه اثرات تمامی آنتی اکسیدانت‌های موجود در خون و مایعات بافتی اتلاق می‌شود. جهت کسب اطلاعات بیشتر در مورد سیستم آنتی اکسیدانتی به مقدمه سایر کیت های آنتی اکسیدانتی مثل کیت سنجش گلوتاتیون موجود در وبسایت مراجعه شود.

اساس سنجش

در این روش ABTS در حضور یک اکسیدانت مناسب به ABTS⁺ سبز اکسید شده که در حضور آنتی اکسیدانت مهار می‌شود. ظرفیت آنتی اکسیدانت تام (TAC) نمونه را می‌توان با اندازه گیری جذب ABTS⁺ در  nm414 اندازه گیری کرد.

تعیین ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی تام در نمونه‌های سرمی، پلاسمایی، بافت، ادرار و .... می‌باشد.

ب) محتویات کیت

 ج) مراحل انجام سنجش

تهیه محلول رادیکال ABTS

برای آماده­سازی رادیکال کاتیونی ABTS  مقدار µl 100 از استوک ABTS را در µl 800 آب دوبار تقطیر حل کرده و سپس روی آن µl 100 از پتاسیم پرسولفات X10 اضافه نمایید. پس از گذشت یک ساعت محلول حاصله که حاوی رادیکال­های آزاد می­باشد به نسبت 1:5 با آب مقطر رقیق شده و جذب آن در طول موج  nm414 در حدود یک تنظیم شود. (در صورتی که جذب بالاتر بود رقیق­سازی شود).

• آماده­سازی استاندارد

محلول­های استاندارد را هم می­توان در لوله­آزمایش و هم در میکروپلیت آماده کرد و جذب آنها را می­توان به ترتیب توسط دستگاه­های اسپکتروفتومتر و میکروپلیت ریدر خواند. جدول زیر برای خوانش توسط اسپکتروفتومتر تنظیم شده است. برای انجام آزمایش توسط روش میکروپلیت مقادیر ذکر شده را 5 برابر کمتر کنید.

از محلول استاندارد mM 10غلظت‌های مختلف mM 1-0 مطابق جدول زیر به ‌صورت سریالی تهیه کنید. سپس به µl 500 از محلول کاری حاوی رادیکال ABTS^.+ ، µl 500 از نمونه­های استاندارد افزوده شده و بعد از 5 دقیقه جذب نمونه­ها در طول موج nm 414 قرائت شود.

• آماده سازی نمونه

- نمونه‌های مایع

شامل نمونه­هایی مثل نمونه­های سرمی، پلاسمایی، بزاق، ادرار، مایع رویی سلولی یا سایر مایعات می­باشند. نمونه‌های خونی باید کاملا سرم یا پلاسما از خون جداسازی شود (همولیز نشود). نمونه‌های ادرار، بزاق یا نمونه‌های مایع مستقیماً برای سنجش استفاده شوند. توصیه می‌شود که از EDTA به عنوان ضد انعقاد استفاده نشود بلکه هپارین یا سیترات سدیم استفاده شود.

- نمونه سلول

سلول‌ها را جمع آوری کنید ( سلول 10⁶˃) توصیه می‌شود به جای تریپسین یا EDTA  از خراش دهنده استفاده شود. سپس آن را در حدود lµ 500 -300 بافر PBS حل کرده و هموژن یا اولتراسونیک کنید تا غشا سلول‌ها کاملا تخریب شده و آنتی اکسیدانت‌ها‌ی آن آزاد شود. لیزات سلول‌ها را به مدت 10 دقیقه در C^°4 با دور g10000 سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برای سنجش غلظت پروتئین و TAC جمع آوری نمایید.

- نمونه بافتی

بافت را بعد از توزین دقیق با نسبت %20 در PBS حل کرده و بطور مکانیکی در یک هاون چینی هموژن نمائید. سپس در g 10000 در C°4 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ نموده و مایع رویی را جمع­آوری شود. مقداری از آن را برای سنجش غلظت پروتئین و باقیمانده را برای سنجش TAC  استفاده کنید.

• سنجش نمونه

برای سنجش مقدار TAC نمونه­های مجهول کافی است µl5-10 از آنها را با آب مقطر به حجم µl 500 رسانده و سپس µl 500 از محلول کاری حاوی رادیکال ABTS^.+ به هر یک از آنها اضافه نمایید. بعد از 5 دقیقه جذب نمونه­ها در طول موج nm 414 قرائت شود.

د)  آنالیز نتایج

مقادیر جذب نمونه‌های استاندارد را در برابر غلظت آن در یک نمودار به صورت زیر ترسیم نمایید سپس معادله‌‌ی خط برازش (trendline) را به دست بیاورید و به کمک معادله y =ax+b مقدار x را برای نمونه مجهول بدست بیاورید.

 در صورت بروز هر گونه ابهام، مشکل یا اشتباه با کارشناسان پشتیبانی فنی آرسام فرا زیست در میان بگذارید. کارشناسان ما با شماره تلفن71-574-71-0914 از طریق تلگرام و یا ایمیل این آدرس ایمیل توسط spambots حفاظت می شود. برای دیدن شما نیاز به جاوا اسکریپت دارید برای ارائه راهنمایی و رفع مشکل حاضر هستند.

پیوست‌ها

دریافت

[TAC Assay]

561 kB