کیت سنجش نیتریک اکساید ( روش گریس)

: آرسام فرا زیست

الف) مقدمه

گونه‌های فعال نیتروژن (RNS) و گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) با همکاری یکدیگر باعث آسیب به سلول می‌شوند که به نوبه خود باعث انواع بیماریها می‌شود. RNS به گروهی از مولکولها گفته می‌شود که از نیتریک اکساید (NO) و آنیون سوپراکسید (O₂^-) که به ترتیب توسط آنزیم‌های نیتریک‌اکساید‌سنتاز ( NOS) و NADPH اکسیداز تولید می‌شوند، مشتق می‌شوند.

NO از اسیدآمینه آرژینین توسط آنزیم نیتریک‌اکساید سنتاز به کمک O₂ و NADPH₂ تولید می‌شود. به طور کلی 4 نوع آنزیم نیتریک ‌اکساید سنتاز وجود دارد، که شامل nNOS (ایزوزیم بافت عصبی و عضلانی)، iNOS (ایزوزیم سیستم ایمنی و قلبی عروقی)، eNOS (ایزوزیم اندوتلیومی) و bNOS (ایزوزیم باکتریایی) می‌باشند.

به علاوه، نیتریک اکساید بهعنوان مولکول افکتور و پیامبر فیزیولوژیک در بسیاری از سیستم‌های زیستی از جمله بافت‌های ایمنی، عصبی و سیستم قلبی عروقی و نیز به عنوان یک میانجی در بیماری‌های متعددی از جمله بیماری‌های عروقی، دیابت، ایسکمی کلیوی، سرطان و بیماری‌های التهابی نقش ایفا می کند. لذا، به دلیل نقش‌ NO در‌ سیستم‌های فوق سنجش مقدار آن در بافت‌ها و مایعات زیستی اهمیت زیادی دارد. علیرغم این، به دلیل طول عمر بسیار ناپایدار آن، کمّی‌سازی مستقیم آن در سیستمها و روش‌های تشخیصی ممکن نیست. بنابراین رایجترین روش اندازهگیری آن سنجش نیتریت (فرآورده نهایی اکسید شده آن) می‌باشد. برای سنجش تشکیل NO، میزان نیتریت (NO₂^–) که یکی از دو فرآورده NO می‌باشد، را اندازهگیری می‌کنند. این مولکول برخلاف NO، پایدار و غیرفرار می‌باشد. این روش برای اولین بار توسط گریس (Griess) ارائه شد و به همین دلیل به تست گریس نیز معروف است.

کیت سنجش NO بر اساس واکنش زیر است که در آن NO₂^–با سولفانیل‌آمید و N-1- نفتیل اتیلن دی آمین دی کلراید (NED) در شرایط اسیدی (فسفریک اسید) واکنش داده و مطابق شکل زیر ترکیب آزو تولید می‌کند.

کیت آرسام فرا زیست NO₂^– را در بسیاری از انواع سیستم‌ها و مایعات بیولوژیک از قبیل پلاسما، سرم، ادرار، محیط کشت سلول و بافت تشخیص می‌دهد. حساسیت کیت حاضرµM 15/0 یا nmol/ml 15/0 می‌باشد.

ب) محتویات کیت

نگهداری: محتویات کیت را در دور از روشنایی و در °C4‌ نگهداری کنید.

ج) آماده سازی استاندارد نیتریت

قبل از هر سنجش نمونه باید یک منحنی استاندارد نیتریت ترسیم شود. استاندارد و سنجشها را میتوان هم در کووت و هم در میکروپلیت انجام داد. برای نیل به این هدف بصورت زیر عمل شود.

1- روش لوله آزمایش یا کووت

- با رقیق کردن 1:100 محلول استاندارد نیتریت موجود در کیت، یک میلی لیتر محلول µM100 استاندارد تهیه کرده و سپس به صورت زیر غلظت‌های سریالی تهیه کنید.

بعد از تهیه غلظت‌های فوق، به µl900 از هر یک از نمونه های استاندارد µl50 از سولفانامید‌ را اضافه کرده و بعد از مخلوط کردن، به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه کنید. سپس µl50 از NED بر روی آن ریخته و بعد از مخلوط کردن در طول موج بینnm 520-540 قرائت شود و نمودار استاندارد آن ترسیم شود.

2) روش میکروپلیت

در این روش تمامی موارد ذکر شده برای فوق به یک پنجم کاهش یابد. بدین صورت که در یک میکروپلیت ته صاف به صورت دو یا سه تکرار مطابق جدول زیر مخلوط واکنش تهیه شود.

به مخلوط فوقµl 10 سولفانامید اضافه کرده و بعد از مخلوط کردن به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود. در نهایت µl 10 از معرف NED به آن افزوده شده و جذب آن در طول موج بین nm 540-520 قرائت و سپس با استفاده از میانگین جذبها منحنی استاندارد آن ترسیم شود.

د) سنجش NO₂^- در نمونه

بسته به روش لوله آزمایش یا روش میکروپلیت به ترتیب µl 20 و یا µl 4 از نمونه را در داخل لوله آزمایش یا چاهک ریخته و سپس به ترتیب بر روی آنµl 880 و یا µl 176 آب مقطر ریخته و مخلوط کنید. در مرحله بعد به ترتیب µl50 و یا µl 10 سولفانامید اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شود، در نهایت بعد از افزودنبه ترتیب µl 50 و یا µl10 معرف NED و مخلوط نمودن، آن را در طول موج بینnm 520-540 قرائت کنید.

ه) آنالیز داده ها

به کمک منحنی استاندارد و با استفاده از معادله خط برازش (Trendline) مقدار X را برای جذب نمونه (های) مجهول پیدا کنید. عدد حاصله مقدار NO را با واحد µM نشان می دهد. با تقسیم عدد NO به مقدار پروتئین موجود (mg/ml) در نمونه مقدار NO برحسب nmol/mg pr به دست میآید. برای محاسبه غلظت NO برحسب nmol/mg pr لازم است غلظت پروتئین را با روش برادفورد یا لوری میتوانید سنجش کنید.

منحنی استاندارد زیر به روش لوله آزمایش انجام، جذب آن توسط اسپکتروفتومتر LKB قرائت شده و رسم شده است.

نکات مهم

1- سولفانیل‌آمید و NED برای اتصال به نیتریت رقابت می‌کنند. برای دستیابی به بیشترین حساسیت دو تا مورد فوق را پشت سر هم و جداگانه اضافه کنید. ابتدا محلول سولفانیل‌آمید را به نمونه اضافه نمایید و بعد از 10-5 دقیقه محلول NED را بیفزایید.

2- برای دستیابی به مقدار دقیق NO₂^–یک منحنی استاندارد به کمک استاندارد موجود در کیت توسط آب مقطر یا بافر موجود در نمونه ترسیم شود. به دلیل حساسیت واکنش گریس با مواد مداخلهگر موجود در محیط واکنش، ممکن است حساسیت کیت تغییر کند.

و) منابع

Iverson NM, Hofferber EM, Stapleton JA. Nitric Oxide Sensors for Biological Applications.Chemosensors.

2018;6(1):8.

Csonka C, Páli T, Bencsik P, Görbe A, Ferdinandy P, Csont T. Measurement of NO in biological samples. Br J Pharmacol. 2015;172(6):1620-32.

Förstermann U, Li H. Therapeutic effect of enhancing endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression and preventing eNOS uncoupling. Br J Pharmacol. 2011;164(2):213-23.