---

الف) مقدمه

آنزیم DNA پلیمراز Pfu یک آنزیم پایدار در برابر دمای بالاست که دارای وزن مولکولی نسبی kDa  92 می‌باشد. این آنزیم دارای منشا پیروکوکوس فیوریوس(Pyrococus furiosus)  می‌باشد و سنتز نوکلئوتیدها را در جهت ´3 → ´5 کاتالیز می‌کند. به علاوه آنزیم Pfu دارای فعالیت اگزونوکلئازی ´5→´3 نیز می‌باشد .( Proof reading) نوکلئوتیدهای غلط در حین سنتز DNA توسط فعالیت تصحیح خطای آن حذف می‌شود. این آنزیم در واکنش های PCR که نیاز به سنتز با صحت بالا دارند کاربرد وسیع دارد. میزان خطای آنزیم 6/2 نوکلئوتید در تکثیر یک میلیون جفت باز می‌باشد.

مسترمیکس (x2) آنزیم DNA پلیمراز pfu یک محلول آماده است که دارای آنزیم pfu، dNTPs، سولفات منیزیم و بافر واکنش در غلظت های بهینه می باشد. به طوری که برای تکثیر کارآمد الگوهای DNA توسط PCR بهینه سازی شده است. برای آماده سازی واکنش PCR کافی است که پرایمرهای پیشرو (Forward) و معکوس (Reverse) و DNA الگو افزوده شود. به کمک مسترمیکس از احتمال خطاهای پیپتینگ (Pipeting)، محاسبات اشتباه و آلودگی ممانعت می شود.

ب) کاربردها

PCR  ،کلونینگ، تکثیر قطعات طولانی و سخت، تکثیر دقیق توالی‌های ژنی باکتری‌ها به منظور تعیین توالی.

ج) محتویات کیت

  

د) شرایط نگهداری

محلول مسترمیکس (x2) بر روی یخ ارسال می شود. به محض دریافت در ºC 20-  نگهداری شود. این مسترمیکس در ºC 4 به مدت سه ماه و یا 15 بار ذوب و انجماد پایدار است. هرگاه روزانه چند بار از محلول مسترمیکس استفاده گردد، از ذوب و انجماد پرهیز و در یخچال نگهداری شود.

ه) ترکیب مسترمیکس pfu

آنزیم DNA پلیمراز pfu در بافر2x  pfu ، dNTPs،3mM  MgSO₄ و بروموفنول بلو مخلوط شده است.

و) روش کار

تمامی محلول ها باید بر روی یخ ذوب شود و به آرامی مخلوط و سانتریفیوژ شود.

1- میکروتیوب PCR روی یخ قرار داده شود و مطابق با جدول زیر حجم واکنش برای lµ 50 مخلوط شود.

 

نکته: DNA الگوی پیشنهادی برای حجم lµ 50 به شرح جدول زیر است.

 

 

2- نمونه را مخلوط و spin کرده تا مخلوط PCR در ته میکروتیوب جمع شود.

3- براساس جدول زیر برنامه دمایی PCR تنظیم و اجرا شود.

 

4- بعد از اتمام PCR می توانید محصول آن را روی ژل برده یا در ºC 20- نگهداری شود.

 

ز) توصیه های عمومی

در طول PCR بیشتر از 10 میلیون کپی از DNA الگو تولید می شود بنابراین به منظور پرهیز از آلودگی با سایر الگوهای DNA که ممکن است در محیط آزمایشگاه وجود داشته باشد، احتیاط­های عمومی باید بکار گرفته شود. توصیه­های عمومی زیر به منظور کاهش احتمال آلودگی توصیه می شود.

1-در فضاهای جداگانه نمونه DNA، مخلوط PCR، چرخه های دمایی و آنالیز محصولات PCR شده، انجام شود.

2- مخلوط PCR در زیر کابینت های لامینار که مجهز به لامپ UV ، انجام شود.

3- در استخراج پلاسمید و مخلوط کردن اجزا PCR دستکش نو پوشیده شود.

4- همیشه واکنش کنترل منفی ]کنترل بدون DNA الگو (No template control= NTC)[ در کنار سایر نمونه­ها برای بررسی آلودگی وجود داشته باشد.