---

الف) مقدمه

آنزیم DNA پلیمراز Pfu یک آنزیم پایدار در برابر دمای بالاست که دارای وزن مولکولی نسبی kDa  92 می‌باشد. این آنزیم دارای منشا پیروکوکوس فیوریوس(Pyrococus furiosus)  می‌باشد و سنتز نوکلئوتیدها را در جهت ´3 → ´5 کاتالیز می‌کند. به علاوه آنزیم Pfu دارای فعالیت اگزونوکلئازی ´5→´3 نیز می‌باشد .( Proof reading) نوکلئوتیدهای غلط در حین سنتز DNA توسط فعالیت تصحیح خطای آن حذف می‌شود. این آنزیم در واکنش های PCR که نیاز به سنتز با صحت بالا دارند کاربرد وسیع دارد. میزان خطای آنزیم 6/2 نوکلئوتید در تکثیر یک میلیون جفت باز می‌باشد.

ب) کاربردهای آنزیم

1-  PCR با صحت بالا

2- تکثیر محصول PCR برای کلونینگ یا بیان ژن

3- جهش زایی هدفدار

ج) منبع آنزیم

ژن آنزیم نوترکیب باکتری پیروکوکوس فیوریوس در E. coli  بیان و تخلیص شده و در بافر ذخیره حاوی گلیسرول و سایر نگهدارنده‌ها ذخیره شده است.

د) محتویات کیت

 

 

نگهداری: کیت Pfu  در روی یخ ارسال می‌شود و بلافاصله بعد از رسیدن در دمای °C  20-  نگهداری شود.     

ه) معرف‌هایی که توسط محقق باید تامین شود:

1- مخلوط dNTP 

2- پرایمرهای پیشرو( Forward ) و معکوس ( Reverse )

3- DNA الگو

4- آب بدون نوکلئاز

و) روش کار

در یک میکروتیوپ استریل و بدون نوکلئاز اجزای زیر را مطابق جدول زیر مخلوط کنید.

 

نکته 1: مقدار آنزیم بستگی به مقدار الگو دارد اما به طور کلی برای µl 50 واکنش و تکثیر طول­های کوتاهتر از kb 2، U  5/2-25/1 متداول  است.

نکته 2:  ضروری است که تمام مراحل بر روی یخ انجام شود و آنزیم Pfu  در انتها افزوده شود تا فعالیت اگزونوکلئازی آنزیم باعث تجزیه پرایمرها نشود.

نکته 3: بلافاصله بعد از افزودن آنزیم و اسپین کوتاه میکروتیوپ، آن را در دستگاه ترموسایکلر که دمای آن از قبل در روی °C 95 تنظیم شده است، قرار دهید.

نکته 4: برنامه PCR  مطابق جدول فوق تنظیم شود. ممکن است برای تکثیر نیاز به بهینه سازی ترکیب پرایمر و الگو باشد.

شرایط چرخه دمایی پیشنهادی برای تکثیر PCR  توسط آنزیم Pfu

 این دستورالعمل برای توالی‌های بین 200 الی 2000 جفت باز در دستگاه Abi  بیوسیستم بهینه­سازی شده است.

 

ز) ملاحظات عمومی

1- غلظت آنزیم

برای واکنش هایی که حجم آنها µl 50 است.  25/1 واحد آنزیم Pfu پیشنهاد می‌شود. زیرا غلظت بالای آنزیم احتمال تجزیه پرایمرها را به دلیل فعالیت اگزونوکلئازی آن افزایش می‌دهد.

2- طراحی پرایمر

توالی پرایمر در تعیین بهترین شرایط برای فعالیت آنزیم حیاتی است. برای پرایمرهایی که Tm بالاتری دارند افزایش دمای اتصال پرایمر توصیه می‌شود. دمای بالا اتصال‌های غیر اختصاصی را به حداقل می‌رساند و مقدار محصول مورد نظر را افزایش و تشکیل دایمرهای پرایمری را کاهش می‌دهد. فعالیت اگزونوکلئازی  ´5→´3 آنزیم ممکن است پرایمرها را تجزیه کند. برای غلبه بر این مشکل توصیه می شود پرایمرهای طویل با میزان GC بالا استفاده شود. می توان با افزودن پیوند فسفوتیولات در انتهای '3 آن نیز از هضم محافظت کرد.

3- زمان تکثیر

زمان تکثیر DNA پلیمراز pfu کمتر از DNA پلیمراز Taq می باشد. بنابراین در برنامه PCR حدود 2 دقیقه برای هر یک کیلو باز توصیه می شود. تعداد چرخه ها 35-30 کافی است.

4- DNA الگو

تعداد چرخه های PCR به مقدار DNA الگو بستگی دارد. برای غلظت های پایین الگو ممکن است تعداد 40 چرخه نیاز باشد.

مقادیر پیشنهادی DNA الگو در یک حجم واکنش µl 50

 

 

 

5- dNTPs

مقدارdNTP  پیشنهادی برای هر نوکلئوتیدmM  2/0 می‌باشد و توصیه می‌شود مقدار برابری از هر 4 نوکلئوتید استفاده شود. هرگاه در برخی از PCR ها مقدار بیشتری dNTP لازم بود، ضروری است که غلظت Mg²⁺  نیز بر اساس آن افزایش یابد.

6- پرایمرها

غلظت پیشنهادی برای پرایمرها بینµM  1-1/0 است. غلظت بالای پرایمر اتصال غیر اختصاصی آنها و تولید محصولات PCR غیراختصاصی را افزایش می‌دهد. در مورد پرایمرهای degenerate  و پرایمرهای مورد استفاده در ‌ PCRهای طولانی غلظت بالایی از پرایمرها در محدوده µM  3-1/0 توصیه می‌شود.

نکته: آنزیم DNA پلیمراز pfu قادر است نوکلئوتیدهای تغییریافته مثل نوکلئوتیدهای متصل به بیوتین، دیژوکسیژنین و فلورسنت را بعنوان سوبسترا در سنتز DNA مورد استفاده قرار دهد.