واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR یکی از روش های رایج در آزمایشگاه های بیولوژی مولکولی می باشد که برای تکثیر بخشی از DNA استفاده می شود. این روش در سال 1983 توسط کری مولیس ابداع و د0 سال بعد یعنی در سال 1993 برنده جایزه نوبل را به خود اختصاص داد. تکنیک PCR با تکثیر قطعه مورد نظر (یک ژن) از یک ژنوم یا کتابخانه ژنی مقدار آن را افزایش میدهند تا در کاربردهایی مثل تحقیقات، تشخیص و پزشکی قانونی قابل استفاده شود.

به طور کلی در تکثیر ژن در  PCR دو مرحله وجود دارد مرحله اول مخلوط اجزای مورد نیاز برای آن و مرحله دوم، برنامه انجام PCR که توسط دستگاه PCR یا ترموسایکلر انجام می شود:

مرحله اول: به طور کلی برای تکثیر قطعه ی مورد نظر DNA در یک میکروتیوب نیاز به اجزای زیر می باشد:

 اجزای فوق که شامل آنزیم DNA Polymerase برای سنتز DNA جدید از روی DNA  الگو به همراه بافر آنزیم، مخلوط از چهار نوکلئوتید (dNTPs) و یک جفت پرایمر رفت و معکوس و DNA الگو می باشد.

بر اساس نوع تکثیر انواعی از آنزیم ها در PCR مورد استفاده قرار می گیرد که ساده ترین و ارزان ترین آنها Taq DNA pol می باشد. از سایر آنزیم ها که در PCR استفاده می شود می توان به  Pfu ، Pwo، Phusion high fidelity، اشاره کرد که بر اساس نوع تکثیر انتخاب می شود.

مرحله دوم: برنامه PCR که توسط دستگاه ترموسایکلر انجام می شود به صورت زیر می باشد.

نکته ای که باید توجه داشت این است که دستگاه ترموسایکلر فقط دما را تغییر می دهد. دستگاه های اولیه در واقع بن ماری بود که در سه دمای متفاوت شامل دمای دناتوراسیون(98-94 درجه سانتی گراد)، دمای اتصال پرایمر(68-55 درجه سانتی گراد) و دمای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز (72 درجه سانتی گراد) تنطیم می شد. 

از آنجایی که تکثیر DNA در PCR لگاریتمی است بعد از 30 چرخه بیش از یک میلیارد از DNA مورد نظر کپی خواهد شد.

بعد از 30 چرخه تکثیر DNA کند می شود و از تکثیر لگاریتمی پیروی نمی کند. گفته می شود دلیل آن اتمام پرایمرها، یا نوکلئوتیدها و یا غیرفعال شدن آنزیم DNA pol می باشد.

به منظور بررسی تکثیر ژن در PCR، بعد از اتمام آن مقادیری از ژن تکثیر یافته بر روی ژل آگاروز برده می شود تا از تکثیر آن اطمینان حاصل شود. باقیمانده محصول تکثیر یافته PCR برای کارهای پایین دست مانند هضم آنزیمی و کلونینگ، تعیین توالی و ... استفاده می شود.

 برای کسب اطلاعات بیشتر در خصوص تاریخچه و کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز به اسلایدهای کارگاه آموزشی در فایل پیوستی زیر رجوع شود. 

پیوست‌ها

دریافت

[اسلایدهای کارگاه PCR]

6105 kB